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上期給大家匯總了一些有關(guān)蛋白質(zhì)測序原理的基礎(chǔ)知識(shí),，這期著重給大家列舉一些蛋白質(zhì)測序?qū)嶒?yàn)中新手可能想問的問題,，希望對網(wǎng)接觸蛋白質(zhì)測序的實(shí)驗(yàn)新手在選擇蛋白質(zhì)測序方法上有指導(dǎo)性幫助。

1-. 蛋白質(zhì)樣品純度較高,，有什么快速的蛋白質(zhì)測序的方法嗎,？

可以通過鑒定蛋白質(zhì)的肽譜圖（Peptide mass fingerprinting,，PMF）達(dá)到快速測定蛋白質(zhì)測序的目的。因?yàn)槊總€(gè)蛋白質(zhì)的序列是特異的,，經(jīng)過特定酶切產(chǎn)生的多肽的質(zhì)量也是一定的,，可以利用這一特性，通過測定蛋白質(zhì)酶切后產(chǎn)生的多肽的質(zhì)量圖譜,，即測定蛋白質(zhì)肽譜圖,，再與數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)酶切的理論肽譜圖進(jìn)行比對，從而推斷出蛋白質(zhì)的序列,。

2. 蛋白質(zhì)肽譜圖鑒定是基于哪項(xiàng)質(zhì)譜技術(shù),？

測定肽混合物質(zhì)量數(shù)有效的質(zhì)譜儀是MALDI-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry），靈敏度高,，譜峰簡單,，每個(gè)譜峰代表一種肽段。MALDI-TOF-MS分析肽混合物時(shí),，能耐受適量的緩沖劑,、鹽，各個(gè)肽片幾乎都只產(chǎn)生單電荷離子,，MALDI-TOF成為進(jìn)行分析PMF的s_h_ǒ_u|選方法,。

3. 肽譜圖鑒定的優(yōu)缺點(diǎn)？

通過測定蛋白質(zhì)肽譜圖分析蛋白質(zhì)序列的方法的優(yōu)勢在于此項(xiàng)技術(shù)只用經(jīng)過以及質(zhì)譜分析來對蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,，測定的速度較快,，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)序列的特異性，肽譜圖法可以推斷出可信度較高的蛋白質(zhì),，也較為精準(zhǔn),。由于肽譜圖測定需要依賴數(shù)據(jù)庫信息比對，對于數(shù)據(jù)庫不包含的蛋白質(zhì),，肽譜圖不能夠進(jìn)行準(zhǔn)確分析,。

4. 準(zhǔn)確度高的蛋白質(zhì)測序法有哪些？

理論上蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)生的肽段圖譜是特定的,，影響蛋白質(zhì)酶切,，以及鑒定肽段質(zhì)量的因素眾多，肽譜圖對蛋白質(zhì)測序來說還是一種比較粗略的測定方法,，更為精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)測定方法包括Edman降解測序法,，串聯(lián)質(zhì)譜測序法等。

5. 如果蛋白樣品中含有多個(gè)蛋白質(zhì),，有什么方法可以一次性對所有蛋白質(zhì)進(jìn)行測序的嗎,？

MS/MS質(zhì)譜鑒定可以檢測一個(gè)蛋白條帶中的多個(gè)蛋白質(zhì)，只需要將蛋白膠切下來送測序即可,，在這個(gè)過程中保證切膠使用的刀具是干凈無污染的,，避免切下旁邊的雜蛋白。質(zhì)譜鑒定公司會(huì)對膠樣中的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切,，再測定肽段序列,，將肽段序列與已知蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，即可獲知膠樣中蛋白質(zhì)的ID,，并推測出蛋白的序列,。

6. Edman降解法能夠?qū)λ械鞍踪|(zhì)進(jìn)行測序？

Edman降解測序法的優(yōu)勢是能夠?qū)ξ粗牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行測序,，目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)近乎完善,，Edman也有一定的局限性,。例如，Edman講解法測序不能夠解決蛋白質(zhì)N端環(huán)化,、封閉的測序問題,，被修飾的蛋白質(zhì)不能給出確切的信號(hào)，這些都在一定程度上限制了Edman降解法的廣泛應(yīng)用,。

7. 對未知的蛋白質(zhì)來說,，如果蛋白質(zhì)的N端有環(huán)化封閉現(xiàn)象，或者N端有未知修飾時(shí),，如何對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行準(zhǔn)確分析呢,？

對于序列未知的蛋白質(zhì)，特別是經(jīng)過改造后的重組蛋白質(zhì),，體外合成蛋白質(zhì),，以及改造的抗體，或者基因序列未被研究過的蛋白質(zhì),，這類蛋白質(zhì)的信息往往不包含在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中,。要實(shí)現(xiàn)對這類蛋白質(zhì)序列的準(zhǔn)確分析就必須通過蛋白質(zhì)從頭測序的方法。蛋白質(zhì)從頭測序法是一項(xiàng)基于質(zhì)譜技術(shù)的分析方法,。與傳統(tǒng)質(zhì)譜鑒定的方法類似,，從頭測序法也是先將蛋白質(zhì)酶切成小的多肽片段，接著經(jīng)由高效液相色譜對多肽片段進(jìn)行分離,，再依次通過兩級質(zhì)譜對多肽片段序列進(jìn)行測定,。相較于傳統(tǒng)質(zhì)譜測序，從頭測序經(jīng)過精密的算法,，保證鑒定的多肽序列，能夠高準(zhǔn)確度推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列,，并且能夠不依賴于數(shù)據(jù)庫比對,，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列從頭測定。

8. 如何對蛋白質(zhì)測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,？

如果一個(gè)蛋白質(zhì)的序列被成功鑒定了,，那么Western blot是很好的驗(yàn)證方法。由于Western blot方法的特異性和靈敏度,，通過Western blot驗(yàn)證的蛋白質(zhì)幾乎可以1_0_0_%確定蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性,，排出質(zhì)譜鑒定的假陽性?？梢赃x取針對蛋白質(zhì)上面某一段序列制備的單克隆抗體進(jìn)行檢測,，再將Western blot的結(jié)果與鑒定的蛋白序預(yù)計(jì)分子量進(jìn)行比對，即可確定蛋白質(zhì)測序結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

9. 已知蛋白質(zhì)序列,，如何對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測？

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測，即從蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)預(yù)測它的折疊和二級,，三級和四級的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),。目前有兩種常用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法：1. 同源建模法，通過已知同源或同一家族中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),，再對目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測,；2. 折疊識(shí)別法，通過已知的蛋白質(zhì)折疊法作為目標(biāo)蛋白質(zhì)折疊的模板,，再根據(jù)數(shù)據(jù)庫推測出匹配的目的蛋白質(zhì)折疊的過程,。

講了這么多實(shí)驗(yàn)新手可能會(huì)關(guān)心的有關(guān)蛋白質(zhì)測序的問題，大家實(shí)際遇到的問題各有不同,，我們在這里就挑選一下具體問題進(jìn)行回答

1-. Edman降解測序是否可以測定含有大概130多個(gè)氨基酸的未知蛋白,？

130個(gè)氨基酸序列比較長，已經(jīng)超出了蛋白質(zhì)Edman測序的限度,，建議使用蛋白從頭測序（de novo se）對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行測定,。蛋白質(zhì)從頭測序不需要借助任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，可以對任何蛋白質(zhì),，包括突變,、經(jīng)過生物改造的非天然蛋白質(zhì)等進(jìn)行測序。

2. 實(shí)驗(yàn)中通過Western blot鑒定出一種目的蛋白,，分子量約29KD,，想直接跑單向SDS-PAGE,切膠進(jìn)行PMF，是否可行,？PMF和Edman降解法那種更好,？

使用SDS-PAGE分離，再將蛋白膠切下來做PMF是完全可行的,。PMF比對的是肽譜圖,，存在一定的假陽性概率，對蛋白純度的要求較高,。建議SDS膠跑開一些,，保證切下來的蛋白膠不被其他蛋白膠影響，切膠的時(shí)候注意不能被角蛋白等雜蛋白污染,。PMF鑒定效率都比N端測序要更高,，價(jià)格也更低。蛋白量,、蛋白純度足夠高的話,，PMF的結(jié)果也是同樣可信的。

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